生物技术克隆动值物观后感选录(2)
2022-05-27 来源:百合文库
pMD-18T vector system、DH5α购自宝生物工程(大连)有限公司;Gel Extraction Kit购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.2 引物设计
以人的基因序列为探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank数据库中搜索同源序列，筛选猪的同源性EST(标准：长度≥200 bp，相似性≥80%)，用DNAStar软件包中的SeqMan程序进行EST序列拼接，参照拼接的contig(重叠群)采用Primer5.0软件设计引物U1F/U1R，U2F/U2R，U3F/U3R等3对引物扩增USF1基因的cDNA序列。参照USF1基因的cDNA序列设计U4F/U4R，U5F/U5R，U6F/U6R，U7F/U7R，U8F/U8R，U9F/U9R等6对引物(表1)扩增USF1基因的序列。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.3 PCR扩增与测序
PCR扩增体系为25 μL，包括50 ng 模板DNA、2.5 mmol/L 1×Taq Buffer、1.5 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTPs、0.5 mmol/L PCR primers、2 U Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性45 s，退火(温度、时间根据引物来确定)，72 ℃延伸90 s，35个循环;最后72 ℃延伸10 min。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，用Gel Extraction Kit试剂盒纯化回收，与pMD-18T vector system连接，并转化大肠杆菌DH5α，将阳性克隆送至北京奥科生物技术有限公司测序。
2 结果与分析
1.2 引物设计
以人的基因序列为探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank数据库中搜索同源序列，筛选猪的同源性EST(标准：长度≥200 bp，相似性≥80%)，用DNAStar软件包中的SeqMan程序进行EST序列拼接，参照拼接的contig(重叠群)采用Primer5.0软件设计引物U1F/U1R，U2F/U2R，U3F/U3R等3对引物扩增USF1基因的cDNA序列。参照USF1基因的cDNA序列设计U4F/U4R，U5F/U5R，U6F/U6R，U7F/U7R，U8F/U8R，U9F/U9R等6对引物(表1)扩增USF1基因的序列。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.3 PCR扩增与测序
PCR扩增体系为25 μL，包括50 ng 模板DNA、2.5 mmol/L 1×Taq Buffer、1.5 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTPs、0.5 mmol/L PCR primers、2 U Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性45 s，退火(温度、时间根据引物来确定)，72 ℃延伸90 s，35个循环;最后72 ℃延伸10 min。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，用Gel Extraction Kit试剂盒纯化回收，与pMD-18T vector system连接，并转化大肠杆菌DH5α，将阳性克隆送至北京奥科生物技术有限公司测序。
2 结果与分析
物品拟人腐肉
