不会做基因敲除细胞株？轻松5步构建流程(2)

4具体原因：只能是肿瘤细胞系，不能是永生细胞系，往往很多永生细胞系做起来都比较有挑战性，当在做基因敲除细胞株时，如果敲除效率是x，则拷贝数是n，那么纯合敲除的效率就是：x^n，可见效果就不显著了。
二. 基因敲除细胞系的敲除方法：
1.建议首选：如果只是做常规的移码敲除，那么一个细胞里面只有2个基因位点，是很难保证两个基因位点是一样的移码，所以得到移码的数据也不同，当你在鉴定测序看图的时候就没有那么清晰，所以，选择片段敲除是一个较为有效的办法。
2.关键点：移码敲除在很多时候并不彻底，会在后续的实验中出现Western Blot的问题，出现神秘的条带，大片段的基因敲除是几kb的缺失，mRNA就没有目的蛋白的转录，Western Blot问题也解决了，鉴定敲除方法：纯合敲除细胞系，比移码敲除效率更高。

3.如何判断是大片段敲除的细胞系：主要是通过目的基因片段对PCR扩增的方式判断。
三. 细胞周期分析：
1.如果采用病毒法，构建载体，病毒包装，转染细胞，细胞筛选，单克隆，PCR鉴定/测序，扩增——一个步骤都不能少。
2.使用转座子系统，构建好敲除质粒后，直接用质粒电转到细胞。
3.做基因敲除细胞株时，不要选择增殖太慢的，如果过表达量的Cas9蛋白 gRNA快速靶向，最快只需要5周时间，7-12周就可以得到纯合子细胞。
四.细胞拿到怎样用：
如果是单克隆的细胞需要大量扩增，完全不用担心培养过程中蛋白恢复的问题，所有的细胞都必须经过严格测试，保证安全无污染，低内毒素可以直接用于动物体内实验，做代谢分析也能更加安心。如果移码突变，大量扩增可能会出现恢复（特别是敲除的蛋白对细胞增殖有优势的情况）细胞动物实验和代谢研究更放心。